Sáu chiếc thuộc lớp Tambor đang có mặt tại khu vực quần đảo Hawaii hay khu vực Trung tâm Thái Bình Dương, đặc biệt là Tautog đang có mặt tại Trân Châu Cảng khi Nhật Bản bất ngờ tấn công căn cứ này vào ngày 7 tháng 12, 1941. Những chiếc khác còn ở lại lục địa Hoa Kỳ khi vừa mới nhập biên chế hay đang chạy thử máy. Hầu hết lực lượng tàu ngầm sẵn có tại Thái Bình Dương đã được phái đến Philippines vào tháng 10, 1941.

Lớp Tambor đã hoạt động tích cực trong Thế Chiến II, với bảy trong số 12 chiếc bị mất, trước khi những chiếc còn sống sót được rút khỏi tuyến đầu vào đầu năm 1941 để làm nhiệm vụ huấn luyện hay thử nghiệm. Đây là lớp tàu ngầm có tỉ lệ tổn thất cao nhất của Hải quân Hoa Kỳ. Tautog (SS-199) đã đánh chìm tổng cộng 26 tàu đối phương, xếp thứ hai về số lượng tàu trong số tàu ngầm Hoa Kỳ có thành tích nổi bật nhất trong chiến tranh.[Ghi chú 1][4]

Sau chiến tranh Tuna được sử dụng như mục tiêu thử nghiệm bom nguyên tử tại đảo Bikini vào năm 1946, trong khuôn khổ Chiến dịch Crossroads. Nó chỉ bị hư hại nhẹ sau thử nghiệm, và cuối cùng bị đánh chìm như một mục tiêu vào năm 1948.